عبدالباسط عزیزی

ویروس پیسک توت-فرنگی (Strawberry mottle virus) متعلق به راسته Picornavirales خانواده Secoviridae جنس Sadwavirus و زیر جنس Stramovirus می‌باشد. ویروس پیسک توت‌فرنگی یکی از مهم‌ترین ویروس‌های توت‌فرنگی است که پراکنش جهانی دارد و چند سالی است که از باغات توت‌فرنگی استان کردستان ردیابی شده است. برای شناخت بیشتر، بررسی مشخصات مولکولی RNA1 چند جدایه این ویروس مورد مطالعه قرار گرفت. برای انجام این تحقیق، چهار جدایه که دارای علائم ویروسی شامل نامتقارن بودن میوه و برگ، کوتولگی بوته، زردی و سوختگی حاشیه برگ بودند، انتخاب شدند و RNA کل آن‌ها با استفاده از روش سیلیکا از بافت برگی گیاه استخراج شد. پس از ساخت cDNA با آغازگرهای تصادفی شش‌تایی، از پنج جفت آغازگر اختصاصی که بر اساس مناطق محافظت شده RNA1 جدایه‌های مختلف این ویروس طراحی شده بودند، برای تکثیر توالی کامل RNA1 جدایه AGH استفاده شد. همچنین بخشی از ژنوم با استفاده از سه جفت آغازگر از سه جدایه PK، SD و KM تکثیر و تعیین توالی شدند. سپس، خصوصیات مولکولی، تجزیه‌وتحلیل تبارزایی و تنوع ژنتیکی این توالی‌ها همراه با جدایه‌های موجود در ژن بانک مورد بررسی قرار گرفتند. بررسی تنوع ژنتیکی هرکدام از ژن‌های RNA1، نشان داد که بیشترین نسبت تعداد کل جهش‌ها مربوط به پروتئین پروتئاز با 04/0 است. همچنین کمترین میانگین تنوع نوکلئوتیدی، کمترین جهش نوکلئوتیدی و کمترین تعداد جایگاه افتراقی مربوط به ژن VPg است. نسبت جایگزینی‌های نا مترادف به جایگزینی‌های مترادف نشان داد که RNA1 این ویروس تحت ‌فشار انتخاب منفی بوده است. در بررسی تبارزایی بر اساس پلی پروتئین RNA1 و ژن پلیمراز، جدایه‌های SMoV دو گروه اصلی و چندین زیرگروه را تشکیل دادند که جدایه‌های ایرانی در گروه اول و در کنار جدایه‌هایی از کشور چک و کانادا قرار گرفتند. همچنین در بخش دیگری از تحقیق، کارایی چندین آغازگر برای ردیابی بهتر جدایه‌های ایرانی مورد مقایسه قرار گرفتند که آغازگرهای SM4F/R که بخشی از ژن پروتئاز و بخشی از ژن پلیمراز را تکثیر می‌کنند، به‌عنوان مناسب‌ترین آغازگرها معرفی شدند.

بگوموویروس‌ها به‌عنوان بزرگترین جنس ویروس‌های گیاهی سالانه خسارت هنگفتی به محصولات کشاورزی وارد می‌کنند. تعداد گونه‌های این جنس در حال افزایش بوده و سالانه تعدادی گونه جدید شناسایی می‌گردند. باتوجه به تغییرات اقلیمی انتظار می‌رود که این ویروس‌ها از مناطق و میزبان‌های جدید نیز گزارش گردند. در این بررسی، تعداد 132 نمونه از بافت برگ برخی از میزبان‌های بگوموویروس‌ها از جمله گوجه‌فرنگی، لوبیا، فلفل، بامیه، خیار، بادمجان، سیب زمینی و کدو از مزارع جالیزی و زراعی شهرستان‌های جنوبی استان کردستان (سنندج، مریوان و کامیاران) در طی تابستان سال‌های 1398، 99 و 1400 جمع‌آوری شد. نمونه‌برداری بر اساس علائم بیماری، از گیاهان مشکوک به آلودگی به بگوموویروس‌ها صورت گرفت و در مواردی هم از گیاهان بدون علائم نمونه‌هایی جمع‌آوری شد. به-منظور بررسی آلودگی نمونه‌ها، استخراج DNA کل از نمونه‌ها صورت گرفته و سپس PCR با استفاده از یک جفت آغازگر دژنره اختصاصی (Bego2F و Bego2R) که بر اساس توالی حفاظت شده بگوموویروس‌ها در ناحیه‌ای‌ مشترک ژن‌های AV1، AC2 و AC3 طراحی شده بود، انجام گرفت. قطعه مورد انتظار حدود 450 جفت‌بازی در 26 نمونه از 132 نمونه مورد مطالعه (69/19% آلودگی کلی) تکثیر شد. از تعداد 26 نمونه آلوده، 11 نمونه توالی‌یابی شدند و آنالیز این توالی‌ها در نرم‌افزار MEGA X نشان داد که توالی همه نمونه‌ها مشابه هم می‌باشند و بلاست آن‌ها نیز با توالی‌یابی‌های موجود در ژنبانک نشان داد که بیشترین شباهت را به میزان 15/86% با جدایه AFTZ15A6-6 مربوط به ویروس Tomato leaf curl Uganda virus (ToLCUV) از تانزانیا دارند. این میزان تشابه با توجه به معیار تعیین‌شده برای مرزبندی گونه‌ها در جنس بگوموویروس (91%)، نشان می‌دهد که احتمالا این جدایه یک گونه مجزا بوده و نیازمند بررسی‌های بیشتر است. همچنین با ترسیم درخت تبارزایی نشان داده شد که این توالی به مجموعه بگوموویروس‌ها تعلق دارد. در این مطالعه بالاترین درصد آلودگی به‌میزان 88/28% مربوط به شهرستان کامیاران بوده و سپس شهرستان‌های سنندج و مریوان با 33/23% و 52/10 % آلودگی به ترتیب در رتبه‌های دوم سوم قرار گرفتند. در بین میزبان‌ها نیز گیاه لوبیا با 40% آلودگی، بالاترین میزان آلودگی و گیاه خیار با 66/6 درصد آلودگی کمترین میزان آلودگی را نشان دادند. با توجه به عدم مطالعه قبلی در زمینه آلودگی گیاهان مختلف به بگوموویروس‌ها در استان کردستان، این اولین بررسی و گزارش از وقوع آلودگی بگوموویروسی در این استان می‌باشد.

ویروس موزائیک خیار Cucumber mosaic virus (CMV) از خانواده Bromoviridae و با دامنه میزبانی وسیع می‌باشد. علائم بیماری CMV در میزبان‌های مختلف بسته به زمینه ژنتیکی میزبان‌های گیاهی و جدایه‌های ویروس متفاوت است. یکی از پروتئین‌های مهم و چند عملکردی CMV پروتئین 2b است که با جلوگیری از شروع مکانیسم خاموشی ژن در بافت‌های مختلف گیاهی امکان بیماری‌زایی ویروس را فراهم می‌کند. به کاربردن dsRNA‌های ویروسی به صورت خارجی می‌تواند سبب خاموشی ژن‌های مورد نظر ‌شود. از آن‌جایی به کارگیری فناوری dsRNA‌های اگزوژن از نظرزیستی ایمن و بدون اثر خارج از هدف است، به طور گسترده‌ برای توسعه آفت‌کش‌های زیستی علیه پاتوژن‌های گیاهی مانند ویروس‌های گیاهی استفاده شده است. هدف از این تحقیق بررسی امکان القای مقاومت در برابر CMV در گیاهان گوجه فرنگی و لوبیا با استفاده از RNA‌های کوچک اگزوژن بود. بنابراین، ساختار ژن حاوی یک توالی کوچک از CMV-2b، (pFGC.2b.h) به سلول‌‌های Agrobacterium tumefaciens LBA4404 منتقل شد و سپس سوسپانسیون سلولی باکتری به زیر برگ‌های تنباکو تزریق شد، تا dsRNA‌های 2b را به صورت گذرا بیان کند. پس از بیان dsRNA‌ها توسط برگ‌های تنباکو، RNA کل از برگ‌های تزریق شده، استخراج گردید و تولید RNA‌های کوچک 2b در برگ های تنباکو توسط stem-loop PCR تائید گردید. سپس RNA کل تنباکو بر روی برگ‌های گوجه فرنگی و لوبیا آلوده اسپری شد. همچنین برای بررسی افزایش پایداری Naked dsRNAs، RNA در نانوذرات رس (LDH-hpRNA) بارگذاری شد. سپس، 4 و 12 روز پس از اسپری RNA و نانوذرات حاوی RNA، غلظت CMV با استفاده از PCR کمی برای ارزیابی اثر dsRNA مورد بررسی قرار گرفت. نتایج به‌دست‌آمده نشان داد که dsRNAهای اگزوژن 2b باعث کاهش بیان 48280 برابری ژن bZIP60 گوجه‌فرنگی شده و جذب RNA‌های اگزوژن توسط گیاهان گوجه‌فرنگی را نشان می‌دهد. کاهش غلظت CMV در گیاهان گوجه فرنگی و لوبیا معمولی 4 روز پس از کاربرد RNA به ترتیب 3/2 و 45530 برابر بود. نتایج qPCR نشان داد که کاهش غلظت CMV در بوته‌های لوبیا 12 روز پس از کاربرد RNA معنی‌دار نبود. نتایج کاربرد RNA‌های بارگذاری شده با نانوذرات LDH در روزهای 4 و 12 پس از کاربرد، کاهش حدود 3 و 2 برابری غلظت CMV را در بوته لوبیا نشان داد. بنابراین، این تحقیق کارایی RNA‌های اگزوژن را برای کنترل CMV و افزایش پایداری RNA با بارگذاری بر روی نانوذرات LDH را نشان داد.

بیماری پوسیدگی ریشه لوبیا توسط بیمارگر خاکزاد Neocosmospora solani (Fusarium solani) ایجاد می شود و خسارت فراوانی در مناطق لوبیا کاری دنیا و ایران ایجاد می کند. هدف پژوهش حاضر بررسی فعالیت ضدقارچی باکتری های اندوفیت جداشده از طوقه و ریشه گیاه لوبیا بر کنترل عامل پوسیدگی ریشه لوبیا N. solani (F.solani)، ارزیابی و مقایسه ژنوتیپ های مختلف لوبیا از نظر درجه مقاومت به بیماری پوسیدگی ریشه و بررسی بیان نسبی دو ژن دفاعی PvLOX و PvD2 در تیمارهای زمانی مختلف می باشد. در طی این مطالعه تاثیر متابولیت های فرار باکتری های Microbacterium foliorum.BORCH، maltophilia.HR Stenotrophomonas و Bacillus halotolerans. BTD بر بهبود رشد گیاه آرابیدوپسیس و لوبیا مورد ارزیابی قرار گرفت. همچنین تاثیر متابولیت فرار حاصل شده از جدایه M. foliorum.BORCH در القاء بیان دو ژن PR1 و PvLOX، تحت تیمارهای زمانی مختلف در گیاه لوبیا بررسی شد. در این مطالعه دو جدایه قارچ بیمارگر از مرکز تحقیقات استان لرستان تهیه شد و 480 جدایه باکتری اندوفیت از ریشه و طوقه گیاه لوبیا در مناطق مختلف کشت لوبیا جمع آوری و جداسازی و خالص گردید. بر اساس نتایج حاصل از آزمون بیماری زایی، جدایه F2 بیشترین توانایی بیماری زایی را از خود نشان داد. پس از انجام آزمون های کشت متقابل و متابولیت فرار، 9 جدایه باکتریایی بر اساس بیشترین تاثیر بازدارندگی بر رشد پرگنه قارچ بیمارگر برای تحقیقات تکمیلی انتخاب گردید. فعالیت ضد قارچی 9 جدایه باکتریایی بر اساس آزمون های ترکیبات خارج سلولی، تولید آنتی بیوتیک، تولید آنزیم های تجزیه کننده ی دیواره ی سلولی، تولید سیدروفور، توانایی حل فسفات و... مورد ارزیابی قرار گرفت. بر اساس نتایج حاصل شده از آزمون کشت متقابل، جدایه xylosoxidans. CTA Achromobacterبا نرخ 58% بیشترین بازدارندگی از رشد پرگنه مربوط به قارچ بیمارگر را نشان داد. همچنین در طی آزمون های متابولیت فرار و تولید ترکیبات خارج سلولی، به ترتیب جدایه های A.xylosoxidans.CTA، maltophilia.HR S، M foliorum.BORCH و maltophilia.HR S با میزان 35/42%، 90/38 %، 78/37% و 85/54% بیش ترین تاثیر را در بازدارندگی از رشد پرگنه قارچ بیمار گر را نشان دادند. بر اساس آزمایش های مولکولی و بیو شیمیایی 5 جدایه به جنس Bacillus و باقی جدایه ها به جنس های Achromobacter، Stenotrophomonas، Pseudomonas و Microbacterium تعلق داشتند. در ارزیابی مقاومت ژنوتیپ های مختلف لوبیا به قارچ N. solani (F.solani) رقم غفار به عنوان رقم مقاوم و رقم یاقوت به عنوان رقم حساس معرفی شد و میزان بیان نسبی دو ژن PvLOX و PvD2 در زمانهای مختلف در این دو رقم با هم اختلاف معنی داری داشتند و در رقم مقاوم نسبت به رقم حساس بیان بیشتری داشتند. متابولیت های فرار جدایه های اندوفیت M. foliorum BORCH، S. maltophilia HR و B. halotolerans. BTD باعث بهبود رشد در گیاه آرابیدوسیس و لوبیا شدند. همچنین بیان نسبی ژن های PR1 و PvLOX در گیاهان لوبیا تیمار شده با متابولیت فرار جدایه M. foliorum.BORCH در زمان های مختلف با هم اختلاف معنی دار داشتندکه این نتایج می تواند به دلیل نقش این ژن ها در فرآیندهای رشد و نمو و مقاومتی گیاه باشد. نتایج این تحقیق حاکی از تاثیر مثبت جدایه های باکتری در جلوگیری از رشد قارچ بیمارگرو افزایش رشد گیاه می باشد و نتایج به دست آنده بیانگر استفاده از ارقام مقاوم لوبیا به عنوان جایگزین مناسب روش های شیمیایی می باشد.

گوجه فرنگی با نام علمی Solanum lycopersicum یکی از سبزیجات مهم مورد استفاده غذایی از تیره Solanaceae می باشد. این گیاه به علت اهمیت اقتصادی و سادگی تحقیق بر روی آن به صورت یکی گیاه الگو در علم ژنتیک و بیوتکنولوژی درآمده است. گیاه گوجه فرنگی نیز مشابه با دیگر گیاهان در معرض آفات و بیماری های متعددی از جمله بیماری های ویروسی و قارچی می باشد. از بیماری های شایع و مهم درگوجه فرنگی می توان به ویروس موزاییک خیار و لکه موجی آلترناریایی اشاره کردکه موجب خسارت در مزرعه و حتی پس از برداشت در این گیاه و محصول آن می شوند. بنابراین بررسی برهمکنش این بیمارگرها با همدیگر یکی از زمینه های تحقیقاتی جهت کنترل این بیماری ها می باشد. یکی از روش های ایجاد مقاومت به بیمارگرها، استفاده از تکنولوژی خاموشی ژن برای ایجاد مقاومت به عوامل بیماری زا در گیاهان می باشد. در تحقیق حاضر، اثر خاموشی ژن 2b ویروس موزاییک خیار در برهمکنش این ویروس با قارچ عامل لکه موجی در گیاهان آلوده به این بیمارگرها و گیاهان سالم مورد مطالعه قرار گرفت. نتایج تحقیق زیست سنجی در شرایط آزمایشگاهی و با استفاده ازروش برگ جدا شده در پتری(detached leaf assay )نشان داد که خاموشی ژن CMV-2b منجر به کاهش خسارت ناشی از قارچ آلترناریا در گیاهان آلوده به ویروس موزائیک خیار می شود. همچنین بررسی بیان ژن bZIP60 که در ارتباط با تنش های زیستی و غیر زیستی می باشد، با استفاده از PCR کمی ، نشان داد که ویروس موزائیک خیار باعث افزایش بیان این ژن در گیاه شده درحالی که بیان سازه ژنی خاموشی 2b pFGC-c.h)) در این گیاه باعث کاهش بیان این ژن نسبت به گیاه دارای سازه کنترل بود. نتایج این بررسی نشان داد که قارچ آلترناریا باعث کاهش بیان این ژن شده، درحالی که در آلودگی همزمان قارچ آلترناریا و CMV ، میزان بیان این ژن نسبت به گیاه سالم کاهش نشان داد. همچنین در این تحقیق اثر سازه بازدارنده مرگ برنامه ریزی شده سلولی در برهمکنش قارچ آلترناریا و CMV مورد بررسی قرار گرفت. نتایج این آزمایش حاکی از این بود که سازه ژنی pPIN 253 حاوی ژن CED-9 باعث جلوگیری از القاء نکروز توسط قارچ شده درحالی که به افزایش غلظت ویروس در بافت گیاه کمک می کند. بنابراین نتایج تحقیق حاضر بیانگر تاثیر مثبت خاموشی CMV-2b در کاهش میزان خسارت قارچ آلترناریا، علاوه برویروس CMV، گیاه گوجه فرنگی بوده و این ژن را به عنوان کاندید مناسبی برای ایجاد ارقام مقاوم به ویروس CMV و قارچ آلترناریا در آلودگی مخلوط این دو بیمارگر معرفی می نماید. همچنین نتایج تحقیق حاضر بیانگر این نکته بود که سازه بازدارنده مرگ برنامه ریزی شده سلولی با اینکه باعث کاهش نکروز توسط قارچ آلترناریا می شود، اما حساسیت به ویروس CMV را افزایش می دهد.

بیماری لکه قهوه ای قارچ خوراکی که توسط Pseudomonas tolaasii ایجاد می شود، منجر به صدمات زیادی به بافت قارچAgaricus bisporus می گردد. این مطالعه مکانیسم های کنترل زیستی توسط باکتری های همستیز جدا شده از قارچ های کلاهک دار خودرو علیه P. tolaasii Pt18 را بررسی کرده است. ترکیبات آلی فرّار (VOCs) و ترکیبات آلی غیر فرّار باکتریایی توانایی بالقوه در کنترل بیمارگر های گیاهی دارند. در این مطالعه پس از غربالگری اولیه ی 40 جدایه ی باکتری همستیزجداشده از قارچ های کلاهک دار خودرو، VOCs های تولید شده توسط باکتری-های همستیزPseudomonas sp. Bi1، Bacillus sp. De3، Pantoea sp. Ma3 و Pseudomonas sp. De1 در شرایط آزمایشگاهی علیه P. tolaasii Pt18 مورد بررسی قرار گرفت. آنالیز کروماتوگرافی-طیف سنجی جرمی (GC-MS) نشان داد که جدایه های همستیز Pseudomonas sp. Bi1 و Bacillus sp. De3 هشت ترکیب وPseudomonas sp. De1، و Pantoea sp. Ma3به ترتیب سیزده و یازده ترکیب VOCs را تولید کردند. همه ی جدایه ها VOCهایی را تولید کردند که علائم بیماری را بطور معنی داری در بافت قارچ کاهش دادند و در سطوح مختلف از رشد P. tolaasii Pt18 جلوگیری کردند. نتایج میکروسکوپ الکترونی آشکار کرد بعد از قرار دادن P. tolaasii Pt18 در معرض VOCs تولید شده توسط Pseudomonas sp. Bi1 و Pseudomonas sp. De1، تعداد سلول های با دیواره و شکل مشخص در مقایسه با شاهد بدون تیمار به مراتب کمتر و آثار تغییر شکل سلولی به وضوح دیده شد. بعلاوه، VOCهای تولیده توسط جدایه های همستیز، فرآیند های تحرک twitching، swimming، swarming، کموتاکسی و تشکیل بیوفیلم در P. tolaasii Pt18 که لازمه ی بیماری زایی هستند را به طور معنی داری کاهش دادند. ترکیبات آلی غیر فرّار باکتری های Pseudomonas sp. De1، Bacillus sp. De3،Sa5 Microbacterium sp. و Sa7 Scandinavium sp. تشکیل بیوفیلم را کاهش و اثر بازدارندگی از رشد P. tolaasii Pt18 را نشان دادند. همه ی باکتری های همستیز فوق بجزء Pseudomonas sp. Bi1 یک یا تعداد بیشتری از ژن های کد کننده ی ترکیبات ضد میکروبی را داشتند. نتایج ما شواهدی مبنی بر اینکه جدایه های باکتریایی قادر به کلونیزه کردن میسلیوم قارچ A. bisporus هستند، را ارائه داد. نتایج نشان داد، همه ی جدایه های همستیز فوق بجز Pantoea sp. Ma3 قادر به بی اثر کردن تولاسین که فاکتور کلیدی در بیماری زاییP. tolaasii Pt18 است، هستند. همچنین نتایج نشان داد، تمامی جدایه های همستیز توانایی کاهش علائم قهوه ای شدن روی کلاهک قارچ خوراکی در مقایسه-ی علائم ایجاد شده با تلقیح P. tolaasii Pt18 به تنهایی را دارند. سطح بیان نسبی ژن AbPPO3 در مرحله ی رشدی میسلیومی و اسپوروفوری A. bisporus به طور قابل ملاحظه ای در تلقیح با P. tolaasii Pt18 افزایش یافت. نتایج مطالعات ما نشان داد، سطح بیان نسبی ژن AbPPO3 در زمان تلقیح جدایه های Pseudomonas sp. Bi1 و Pantoea sp. Ma3در بافت قارچی به طور قابل ملاحظه ای کمتر از سطح بیان نسبی تلقیح P. tolaasii Pt18 به تنهایی بود. بطور کلی، یافته های موجود دراین مطالعه کارایی باکتری های همراه قارچ ها را در کنترل زیستیP. tolaasii و امکان استفاده از این جدایه ها را به عنوان عوامل میکروبی مفید برای مدیریت بیماری لکه قهوه ای قارچ خوراکی نشان داد.

شته توتون (Myzus persicae nicotianae) یکی از آفات مهم توتون است که بیش از صد گونه ویروس گیاهی را منتقل می کند. یکی از جدیدترین و کم خطرترین روش ها جهت کنترل حشرات ناقل بیماری، استفاده از ارقام مقاوم می باشد. یکی از روش های ایجاد مقاومت، به کارگیری تکنولوژی RNA مداخله گر (RNAi) می باشد که طی آن یک مولکول RNA به صورت دو رشته ای (dsRNA) در آمده و از بیان آن ژن خاص جلوگیری شده و باعث خاموشی آن می شود. با توجه به تحقیقات قبلی مبنی بر اینکه ژن 2b ویروس موزائیک خیار باعث حساسیت گیاهان به شته ها می شود، در این تحقیق با خاموشی این ژن در گیاهان آلوده به ویروس، مقاومت گیاهان به شته توتون مورد ارزیابی قرار گرفت. جهت ارزیابی مقاومت گیاهان توتون به شته توتون جدول زندگی و پارامترهای دموگرافی 4 تیمار توتون (گیاه آلوده به ویروس بدون سازه ژنی، گیاه آلوده به ویروس دارای سازه ژنی، گیاه آلوده به ویروس موزائیک خیار به عنوان کنترل مثبت و گیاه سالم به عنوان کنترل منفی) مورد بررسی قرار گرفتند. این مطالعه در دو آزمایش ترجیح میزبانی و بررسی پارامترهای رشد جمعیت صورت گرفت. این آزمایش در دمای 5 ± 25 درجه سلسیوس، رطوبت نسبی 5 ± 65 درصد و دوره نوری 16 ساعت روشنایی و 8 ساعت تاریکی انجام شد. به منظور ارزیابی ترجیح میزبانی شته توتون، از تعداد شته موجود به ازای هر برگ توتون به عنوان شاخص مقایسه استفاده گردید. با انجام آزمون T. test در سطح احتمال 5 درصد، نتایج نشان داد که از نظر میزان آلودگی به شته بین تیمارهای مورد آزمایش اختلاف معنی-داری مشاهده می شود، به گونه ای که تیمار ویروس و تیمار دارای سازه ژنی به ترتیب بیشترین و کمترین میزان جلب شته به ازای هر برگ توتون را داشتند. براساس نتایج بدست آمده از اندازه گیری پارامترهای دموگرافی، تیمارهای مختلف توتون اختلاف معنی داری روی طول دوره مراحل پوره سن سوم، پوره سن چهارم، پیش از بلوغ ماده و حشره کامل ماده این آفت نشان داد، همچنین بررسی پارامترهای تولیدمثل نشان داد که به جز دوره پیش از پوره زایی، اختلاف معنی دار بین تیمارها وجود دارد. بررسی پارامترهای رشد جمعیت نیز نشان داد که کمترین نرخ ذاتی افزایش جمعیت (rm) روی تیمار دارای سازه ژنی (246/0 بر روز)، کمترین نرخ خالص تولیدمثل (r0) روی تیمار دارای سازه ژنی (04/17 ماده/ نسل)، کمترین نرخ متناهی افزایش جمعیت (λ) روی تیمار دارای سازه ژنی (279/1 بر روز) و بیشترین مدت زمان یک نسل (T) روی تیمار ویروس (834/11 روز) مشاهده شد. نتیجه این تحقیق نشان داد که در بین تیمارهای مورد بررسی، تیمار دارای سازه ژنی نسبت به شته توتون مقاوم بوده و تیمار ویروس از بقیه حساس تر می باشد.

امروزه آلودگی خاک ها به فلزات سنگین خصوصا آرسنیک به معضلی جهانی تبدیل شده است. علاوه بر این استفاده از کود های شیمیایی منجر به افزایش این آلودگی ها شده است و. بنابراین رشد گیاهان در این خاک ها، و همچنین تولید محصولات سالم با مشکل مواجه شده است. باکتری های اندوفیت مقاوم به آرسنیک با تحریک تولید محرک های رشد، و هورمون های گیاهی فیتوهرمون ها و همچنین فراهم کردن نیتروژن و فسفر مورد نیاز گیاه علاوه بر اینکه می توانند جایگزین خوبی برای کودهای فسفاته و نیتروژنه باشند همچنین می توانند منجر به رشد بهتر گیاهان در خاک های آلوده به آرسنیک و تولید محصلات سالم تر شوند. در این تحقیق باکتری های اندوفیت از ریشه گیاهان نخود و یونجه ی رشد یافته در خاک های آلوده به آرسنیک شهرستان قروه جداسازی شدند. بررسی درخت فیلوژنی تبارزایی براساس توالی نوکلئوتیدی مربوط به ژن 16s rDNA باکتری های جداسازی شده نشان دهنده ی تعلق جدایه ها به جنس های Pseudomonas،Rahnella و Acinetobacter بود. که باکتری های Pseudomonas sp. و Rahnella sp. از نخود و باکتری Acinetobacter sp. از یونجه جداسازی شدنده بودند. نتایج آزمون تست های بیوشیمیایی نشان دهنده ی توانایی تولید لیپاز توسط جنس سویه های Acinetobacter و Rahnella، تولید پروتئاز توسط جنس سویه Pseudomonas، تثبیت نیتروژن توسط جنس سویه Rahnella و تولید آنزیم فسفاتاز توسط هر سه باکتری بود. همچنین وجود ژن آرسنات ردوکتاز در سویه های Acinetobacter و Rahnella اثبات شد. همچنین نتایج نشان داد که باکتری های Pseudomonas و Rahnella به ترتیب توانایی رشد در غلظت های 300 و 250 میلی مولار آرسنیک را دارا بودند و باکتری Acinetobacter نیز توانایی رشد در غلظت 250 میلی مولار آرسنیک را دارا بود.داشت. تاثیر همزمان آرسنیک در غلظت های 0، 10، 50، 75 و 100 میلی گرم بر کیلوگرم خاک و تاثیر تلقیح باکتری های جداسازی شده بر فاکتور های رشدی گیاه هان های یونجه و نخود همانند تعداد گره، ارتفاع اندام های هوایی و زمینی و همچنین وزن خشک و تر ریشه، ساقه و برگ مورد بررسی قرار گرفته و نتایج حاکی از توانایی سویه ها در کلونیزاسیون اندام های مختلف گیاه بود. و همچنین در اکثر تیمارها مشاهده شد که در بسیاری از موارد آرسنیک باعث کند شدن رشد گیاه و تلقیح باکتری منجر به افزایش رشد گیاه گردید.شده است. جهت بررسی القای مقاومت عمومی مسیر SAR یا ISR توسط این باکتریهای اندوفیت، بررسی بیان ژن NPR3 با روش qRT-PCR در تعدادی از تیمار ها انجام گرفت. نتایج بدست آمده مشاهده شده حاکی از کاهش بیان ژن NPR3 در اثر تلقیح باکتری ها بود. هرچند که در گیاه نخود تاثیر آرسنیک بر بیان این ژن مشهود نبود، اما در گیاه یونجه آرسنیک منجر به افزایش بیان NPR3 شد. نتایج به دست آمده تائید کننده ی اثر مثبت باکتری های اندوفیت بر رشد گیاهان در خاک های آلوده به آرسنیک بود.

L. theobromae یک قارچ بیماری زای گیاهی است که داری گسترش جهانی بوده و در مناطق دارای آب و هوای گرم خسارت زا است. L. theobrome یک پاتوژن گیاهی با دامنه میزبانی وسیع می باشد و در گونه های مختلف گیاهان چوبی باعث پوسیدگی میوه، شانکر، سرشاخه میری و زوال می شود. در مو و توت فرنگی عامل شانکر و مرگ سرشاخه می باشد. جهت مدیریت این قارچ امروزه روش های زراعی متداول مانند محافظت از زخم های ناشی از هرس با استفاده از سموم شیمیایی به کار گرفته می شود. روش های کنترل شیمیایی برای محیط زیست مخرب بوده و همچنین اثرات سمی بقایای آن در محصول مشکل ساز می باشد، از سوی دیگر روش های کنترل زیستی نیز تحت تاثیر اقلیم بوده و برای کنترل این بیماری کارایی کافی ندارند. بنابراین لزوم استفاده از ارقام مقاوم در برنامه های مدیریتی ضروری به نظر می رسد. یکی از روش های ایجاد مقاومت در گیاهان، که در سال های اخیر مورد مطالعه قرار گرفته است، استفاده از سیستم خاموشی ژن برای ایجاد مقاومت گیاهان به بیمارگرها می باشد. بنابراین در این تحقیق بررسی کارایی خاموشی در کنترل این قارچ مورد بررسی قرار گرفت. به این منظور از میان ژن های اختصاصی قارچ که دارای تشابه توالی با گیاه میزبان و انسان نبودند، ژن TEF1-α انتخاب شد. بر همین اساس برای انجام آزمون مقامت گذرا سازه پلاسمیدی pFGC-TEF1-α-d طراحی و ساخته شد. آزمون بیماری زایی روی دو رقم Camarosa و Ventana از توت فرنگی و رقم بی دانه مو نشان داد که بیماری زایی L. theoromae در ارقام و گیاهان مختلف متفاوت است، همچنانکه در رقم Camarosa توت فرنگی پس از سه روز علایم نکروز مشاهده می شود اما در رقم Ventana پنج روز پس از آلودگی علایم نکروز ظاهر می شود. نتایج این تحقیق با روش بیان گذرا نشان داد که کارائی سازه نیز در ارقام مختلف می تواند متفاوت باشد. در مورد توت فرنگی و مو مشاهده گردید سرعت گسترش بیماری در گیاه اگروفیلتراسیون شده با سازه ژنی نسبت به شاهد بسیار کندتر می باشد. بنابراین سازه ساخته شده در کاهش شدت و گسترش بیماری تاثیر معنی داری داشت.

ویروس لکه سبزرد برگ سیب متعلق به جنس Trichovirus و خانواده ی Betaflexiviridae است. این ویروس گسترش جهانی دارد و در میزبان های بسیاری مانند سیب، گلابی، هلو و گیلاس گزارش شده است. هدف از این مطالعه، بیان ژن پروتئین پوششی(CP) ویروس لکه سبزرد برگ سیب در باکتری Escherichia coli بدون نیاز به خالص سازی ویروس برای تولید پادتن بود. بیان پروتئین پوششی نوترکیب، نیاز به خالص سازی ویروس را که مستلزم وجود اولتراسانتریفوژ است، مرتفع می سازد. به منظور تولید پروتئین پوششی نوترکیب، جدایه SSa از میزبان سیب جداسازی و ژن کامل پروتئین پوششی آن به طول 582 جفت باز با آغازگرهای اختصاصی تکثیر شد. ژن کامل CP به حامل همسانه سازی pTG19 متصل و در باکتری E. coli سویه DH5α ترانسفورم شد. باکتری های تراریخت شده به پلاسمید نوترکیب روی محیط کشت LB حاوی آمپی سیلین X-Gal و IPTG غربال و پلاسمید نوترکیب به روش لیز قلیایی استخراج گردید. پلاسمید استخراج شده با آنزیم های BamHl و XhoI با محل اثر در دو طرف محل اتصال دی ان ای خارجی برش داده شدند، قطعه ی مورد نظر پس از خالص سازی به حامل بیان pET28a(+)اتصال داده شد. pET28a(+) حاوی ژن CP ویروس ACLSV در باکتریBL21 E. coli ترانسفورم و سپس القای بیان CP با اضافه نمودن IPTG در غلظت نهایی 1mM پس از چهار ساعت SDS-PAGE بررسی شد. نتایج حاصل از SDS-PAGE حاکی از بیان پروتئین مذکور بود.

قارچ Ascochyta rabiei بیمارگر مهم و عامل بیماری برق زدگی نخود بوده و دارای پراکنش جهانی می باشد. این بیماری می تواند باعث کاهش 100% محصول نخود زراعی شود. سیستم تولیدمثلی قارچ می تواند دینامیک ژنتیک جمعیت و تکامل قارچ و همچنین اپیدمیولوژی و مدیریت عامل بیماری را تحت تاثیر قرار دهد. با توجه به این که تاکنون هیچ گونه اطلاعاتی از ساختار ژنتیکی و مرحله جنسی این قارچ در استان کردستان در دست نیست، لذا این تحقیق با اهداف تعیین تنوع ژنتیکی بین و درون جمعیت های قارچ A. rabiei با استفاده از پنج جایگاه SSR و ایدیومورف های تیپ آمیزشی انجام شد. در مجموع 147 جدایه قارچ A. rabiei از مزارع مختلف شش منطقه از استان کردستان جمع آوری گردید. به منظور بررسی ساختار ژنتیکی، شاخص های تنوع ژنتیکی محاسبه و توزیع تیپ های آمیزشی بررسی گردید. جایگاه های SSR در تمام شش جمعیت از چندشکلی 100 درصدی برخوردار بودند و تعداد کل آلل ها در جایگاه های SSR از 10 تا 24 آلل متغیر بود. تجزیه و تحلیل واریانس مولکولی (AMOVA) نشان داد که بیشترین مقدار تنوع ژنتیکی (89 درصد) در درون جمعیت ها و 11 درصد تنوع در بین جمعیت ها توزیع شده بود. تنوع ژنی کل (Ht) برابر 83/0 برآورد شد. تمایز ژنتیکی (Gst= 0.16) بین جمعیت ها معنی دار بود و جریان ژنی (Nm) 61/2 محاسبه گردید. تعداد ژنوتیپ های مشاهده شده از 26 ژنوتیپ در جمعیت Z تا نه ژنوتیپ در جمعیت N متغیر بود و شاخص تنوع ژنوتیپی کل 98/0 محاسبه شد. نسبت تیپ های آمیزشی در جمعیت های N، D و Z از نسبت 1:1 انحراف داشت (05/0p<). در جمعیت های W، B و G نسبت تیپ های آمیزشی 1:1 محاسبه گردید. نتایج این تحقیق نشان داد که بین جدایه های جمع آوری شده از مناطق مختلف استان کردستان تنوع ژنتیکی بالا و سیستم تولیدمثلی مخلوط شامل جنسی و غیرجنسی در جمعیت های A.rabiei وجود دارد. به طور کلی نتایج نشان داد که جمعیت های مورد بررسی، پتانسیل بالایی برای غلبه بر مقاومت در ارقام مقاوم نخود دارند.

زنبورعسل یکی از مهم ترین حشرات اجتماعی شناخته شده درجهان می باشدکه نقش مهمی در زمینه کشاورزی و پزشکی دارد، به گونه ای که ارزش گرده افشانی زنبور عسل را از حدود 60 تا 143 برابر افزایش می دهد. شناسایی جمعیت های زنبورعسل ایرانی (Apis mellifera meda) از اهمیت زیادی برخوردار بوده و یکی از روش های مطالعه جمعیت های زنبورعسل ایرانی، مطالعه ی خصوصیات ژنتیکی آن ها است. در این تحقیق جهت شناسایی خصوصیات ژنتیکی جمعیت های زنبورعسل ایرانی، نمونه برداری از تمام استان های ایران (31 استان) انجام شد. سپس با استفاده از PCR نواحی ژنی ND4-ND4L-ND6 تمام نمونه ها تکثیر شده و پس از توالی یابی ژنهای مورد نظر جهت مقایسه بین جمعیتها و زیر گونههای مختلف زنبور عسل از روش پارسیمونی وبیزی(Basian) از نرم افزار PAUP4.0 و Mrbayes استفاده گردید. نتایج نشان دهنده قرارگیری جمعیتهای ایرانی زنبورعسل (A. m. meda) در سه گروه بود. همچنین نتایج نشان داد که نمونه جمع آوری شده از گیلان در شاخه مربوط به زیر گونه کارنیکا قرار می گیرد (A. m. Carnica) مقایسه توالی نمونه های جمع اوری شده از ایران با زیر گونه های موجود در پایگاه داده NCBI به خوبی نشان داد که مجموع ژن های ND4-ND4L-ND6 به خوبی قادر به جدایی گروههای تکاملی و زیر گونههای زنبور عسل از یکدیگر تفکیک می باشد. همچنین این ژنها گونههای زنبور عسل را براساس محل زندگی (درمحیط تاریک و باز) به خوبی از یکدیگر تفکیک نمودند. بنابراین این تحقیق نشان داد که نواحی ژنی انتخاب شده در این تحقیق می تواند در مطالعات مربوط به شناسایی گونه های مختلف زنبورعسل براساس محل زندگی و همچنین مطالعات رفتار شناسی زنبور عسل به کار گرفته شوند.

ویروس لکه حلقوی نکروتیک هسته داران (PNRSV) یکی از ویروس های مهم درختان هسته دار می باشد که هر سال خسارت فراوانی را با کاهش کمی و کیفی میوه ها موجب می شود. به منظور بررسی وضعیت PNRSV در استان کردستان، 149 نمونه مشکوک به آلودگی از میزبان-های هسته دار و دانه دار طی سال های 1394 و 1396 جمع آوری و استخراج RNA از بافت برگی با روش سیلیکا انجام شد. سپس، سنتز cDNA با آغازگرهای شش تایی تصادفی انجام و حضور PNRSV در نمونه ها با آغازگرهای اختصاصی ژن پروتئین پوششی در آزمون RT- PCR بررسی شدند. نتایج RT- PCR نشان داد که در مجموع 31 نمونه (8/20 درصد) آلوده به PNRSV بودند. به منظور بررسی آنالیز تبارزایی، تنوع ژنتیکی و فشار انتخاب بر ژن پروتئین پوششی این ویروس، 13 جدایه Sal53،SZ93 ، SZ26، BH11،KH10 ، DG1، B5، M، K6، S2، M4، D4 و D7 با توجه به میزبان و منطقه جغرافیایی انتخاب و ژن پروتئین پوششی آن ها پس از اتصال در پلاسمید pTG19، در باکتری E. coli همسانه سازی و تعیین توالی نوکلئوتیدی شدند. توالی های حاصل سپس با 37 جدایه قابل دسترس در پایگاه داده های نوکلئوتیدی از جمله جدایه های تعیین توالی -شده از ایران مورد مقایسه قرار گرفتند. نتایج مقایسه دو به دوی 553 نوکلئوتیدی از ژن پروتئین پوششی جدایه های توالی یابی شده در این تحقیق نشان داد که این جدایه ها 100-96 درصد در سطح اسید نوکلئیکی و 100-92 درصد در سطح آمینواسیدی با هم تشابه دارند. بیشترین نزدیکی بین جدایه های KH10، SZ93 و D7 با جدایه SHN-40 (KX353935) از ایران با 98% تشابه مشاهده شد و کمترین نزدیکی بین جدایه SZ26 با جدایه Emp (DQ983499) از لهستان با %6/83 تشابه مشاهده شد. بررسی نوترکیبی با RDP4 نشان داد که نوترکیبی در این قسمت از ژنوم اتفاق نیافتاده است و تغییرات در اثر جهش های نقطه ای به دست آمده است. همچنین نسبت های کم جانشینی مترادف به غیر مترادف (dN/dS) نشان داد که انتخاب منفی نقش عمده ای را در تکامل این ژن ویروس بازی کرده است. در آنالیز تبارزایی، جدایه های این تحقیق به همراه سایر جدایه های ایرانی در گروه تبارزاییPV96 قرار گرفتند. بر اساس اطلاعات موجود، این اولین گزارش از حضور PNRSV در باغات استان کردستان می باشد.

نخود یکی از گیاهان مهم خانواده بقولات می باشد که بسیاری از بیماری های قارچی باعث بیماری و عامل محدودکننده این گیاه می باشد. یکی از مهم ترین بیماری قارچی در نخود، برق زدگی می باشد که در بسیاری از مزارع خسارت 100% به گیاه وارد می کند. در رابطه متقابل گیاه و پاتوژن، پس از شناسایی پاتوژن، مجموعه ای از مکانیسم های دفاعی از طریق انتقال آبشارهای سیگنالی، ژن های دفاعی متعدد در نخود بیان می شوند. در این مطالعه ژن های AFP-ca، CaD2، LRR و PGIP انتخاب شدند و پاسخ گیاه نسبت به پاتوژن در دو ژنوتیپ مقاوم و حساس به پاتوژن A. rabiei مورد بررسی قرار گرفت. کشت نخود در سه تکرار در سیستم گلخانه ای برای هر دو رقم انجام شد. هم چنین با گیاه شاهد در شرایط یکسان مورد آزمایش قرار گرفت. استخراج RNA از ژنوتیپ مقاوم ICC12004 و ژنوتیپ حساس FLIP82-150c با استفاده از کیت RNX-Plus در زمان های 0، 6، 12، 24، 48، 72 و 96 ساعت پس از مایه زنی گیاه با قارچ A. rabiei انجام شد. بیان ژن های انتخاب شده پس از مایه زنی با قارچ در ارقام مقاوم و حساس با استفاده از RT-PCR نیمه کمی اندازه گیری شد. نتایج نشان داد که سطح بیان ژن های CaD2، AFP-ca و PGIP در گیاه مقاوم نسبت به بیماری A. rabiei افزایش یافت. هم چنین نتایج نشان داد که بیان ژن LRR در مقایسه با سایر ژن های کاندید، سطح بیان در رقم مقاوم نسبت به رقم حساس کمتر بود. نتایج نشان داد که ژن های انتخاب شده CaD2 و AFP-ca از خانواده پپتیدهای ضدمیکروبی در ارقام مقاوم در زمان های اولیه 24-6 ساعت پس از مایه زنی و هم چنین ژن PGIP از خانواده پروتئین های مهارکننده گالاکتوروناز در زمان 48 ساعت پس از مایه زنی حداکثر بیان را نشان می دهند. به طور کلی می توان نتنیجه گیری کرد که تمام ژن های مورد بررسی این تحقیق از جمله ژن LRR، به فعالیت های درونی گیاه کمک کرده و در برابر بیماری برق زدگی پاسخ مقاومتی نشان می دهند.