Mohammad Hajizadeh

Strawberry mottle virus (SMoV) is the most important virus of strawberries that has global distribution. The virus has been detected in strawberry fields in Kurdistan Province for several years. To better understand of Iranian isolates, molecular characterization of several isolates was studied based on the RNA1. To do this, four isolates that had viral symptoms including fruit and leaf asymmetry, plant dwarfism, yellowing and leaf margin burns were selected and their total RNA was extracted using the silica-capture method. After synthesizing cDNA using random hexamer primers, five pairs of specific primers, which were designed based on the conserved regions of RNA1, were used to amplify the complete sequence of RNA1 of AGH isolate. In addition, 3’ part of the RNA1 was amplified and sequenced from PK, SD and KM isolates using three pairs of primers. Then, the molecular characterization, phylogenetic analysis and genetic diversity of these sequences were investigated along with the sequences retrieved in the GenBank. Determinant of genetic diversity of each coding region of RNA1 showed that the highest ratio of the total number of mutations is related to the protease protein with 0.04. Also, the lowest average pairwise nucleotide diversity, the lowest number of nucleotide mutation and the lowest number of the average of nucleotide differences were obtained for the VPg. The ratio of non-synonymous substitutions to synonymous substitutions (dN/dS) showed that RNA1 of this virus was under negative selection pressure. In the analysis of phylogeny based on polyprotein RNA1 and polymerase coding region, SMoV isolates formed two main groups and several subgroups, and the Iranian isolates were placed in world clade along with isolates from the Czech Republic and Canada. Also, in another part of the research, the efficiency of several primers pair were compared for better detection of Iranian isolates, and SM4F/R primer pair, which amplified a part of the protease gene and a part of the polymerase gene, are introduced as the most suitable primers.

Begomoviruses, as the largest genus of plant viruses, cause significant crop losses worldwide. The number of begomovirus species is increasing annually, and due to climate change, the emergence of begomoviruses is predicted to become a serious concern. This is due to the emergence of new species or an expansion of their host range and geographical distribution. In this study, 132 samples were collected from symptomatic and symptomless leaf tissues of various begomovirus hosts, including tomatoes, beans, peppers, okra, cucumbers, eggplants, potatoes, and green squash. Sampling was conducted during the summers of 2019, 2020, and 2021 in the southern part of Kurdistan province (Sanandaj, Marivan, and Kamyaran. DNA extraction was performed from all samples, followed by PCR using a pair of specific degenerate primers (Bego2F and Bego2R). These primers were designed based on conserved sequences belonging to the overlap region of the AV1, AC2, and AC3 genes of begomoviruses. The expected DNA fragment (450 bp) was amplified from 26 samples, accounting for 19.69% of the total samples. Among the 26 amplified fragments, 11 were sequenced. A BLAST search in NCBI and phylogenetic analysis using Mega X software revealed that all 11 sequences were identical and belonged to the begomovirus genus. The BLAST search with sequences available in the NCBI GeneBank showed the highest similarity to an isolate of Tomato Leaf Curl Uganda virus (ToLCUV) (AFTZ15A6-6) from Tanzania, with a similarity of 86.15%. The low sequence similarity, which was below the demarcation threshold for begomoviruses (91%), suggests that this virus could be considered a new species. Therefore, the identification of this virus requires further investigation. The highest rate of infection was recorded in Kamyaran (28.88%), followed by Sanandaj and Marivan with infection rates of 23.33% and 10.52%, respectively. Among the studied hosts, beans showed the highest percentage of infection (40%), while cucumber exhibited the lowest percentage of infection (6.66%). This research represents the first investigation and report of the occurrence of begomoviruses in Kurdistan province.

ویروس ساقه شیاری سیب ASGV) Apple stem grooving virus,) به دلیل انتقال آسان، تاخیر در علائم ظهور و ریشه کنی سخت یکی از ویروس های مهم درختان سیب می‌باشد. به منظور تعیین توالی کامل دو جدایه ایرانی این ویروس، یک جدایه از سنندج (K) و یک جدایه از مرند (Mn18) بر اساس نوع رقم و فاصله جغرافیایی انتخاب شدند. ژنوم این دو جدایه توسط شش جفت آغازگر اختصاصی که کل ژنوم به استثنای انتهای ناحیه poly A و ناحیه 5ˊUTR را پوشش می دادند، تکثیر و توالی یابی شد. ژنوم این ویروس در هر دو جدایه یک چهارچوب خوانش کدکننده به طول 6315 نوکلئوتیدی را تشکیل دادند که یک پلی پروتئین با 2105 اسید آمینه را کد می کنند. آنالیز BLASTn و BLASTx نشان داد که این توالی ها متعلق به ویروس ساقه شیاری سیب هستند و در مقایسه با دیگر جدایه-های این ویروس در ژن بانک، جدایه K با جدایه BR-Gala1 از برزیل و جدایه Mn18 با جدایه 13TF138 از کانادا بیشترین تشابه نوکلئوتیدی را نشان دادند. همچنین، این دو جدایه در مقایسه با هم 3/96% تشابه نوکلئوتیدی داشتند. در آنالیز نوترکیبی، سیگنالی مبنی بر نوترکیب بودن این دو جدایه شناسایی نشد. در آنالیز تبارزایی بر اساس توالی کامل ژنوم، جدایه‌های موجود در ژن بانک همراه با دو جدایه این تحقیق در دو گروه مجزا قرار گرفتند که جدایه های این تحقیق در گروه دوم و زیر گروه W1همراه با جدایه هایی از کانادا، برزیل، آلمان و چین قرار گرفتند. در بررسی ژنتیک جمعیت شش منطقه از ژنوم این ویروس، چهار منطقه دارای فشار انتخاب منفی قوی ولی دو منطقه با عملکرد نامشخص دارای فشار انتخاب مثبت بودند. بررسی های آنالیز تبارزایی و ژنتیک جمعیت این ویروس نشان داد که به احتمال زیاد شرق آسیا منشا این ویروس می باشد. این اولین گزارش از تعیین توالی کامل ژنوم ویروس ساقه شیاری سیب در ایران است.

ویروس پیسک توت فرنگی (Strawberry mottle virus, SMoV) یکی از ویروس های مهم توت فرنگی است که پراکنش جهانی دارد. در طی تابستان سال های 97-1399، تعداد 188نمونه برگی با علائم شبه ویروسی و بدون علایم به منظور ردیابی SMoV از باغات توت فرنگی استان کردستان جمع آوری شد. RAN کل از نمونه ها با روش سیلیکا استخراج و cDNA آن ها با آغازگرهای تصادفی شش تایی ساخته شد. PCR با آغازگرهای اختصاصی انجام شد و قطعه ای به طول 461 جفت باز در 51/58 درصد از نمونه های مورد مطالعه تکثیر گردید. به منظور اطمینان از نتیجه RT-PCR، پنج جدایه انتخاب و پس از اتصال به پلاسمید pTG-19 در باکتری Escherichia coli ترانسفورم و پلاسمیدهای نوترکیب همسانه شده تعیین توالی شدند. نتایج توالی یابی نشان داد که این جدایه ها بیش از 90 درصد با جدایه های موجود در ژنبانک همپوشانی در سطح نوکلئوتیدی دارند. سپس، به منظور بررسی حضور شته ناقل در باغات توت فرنگی استان، تعدادی از نمونه ها به گیاه محک Fragaria vesca با کمک شته جمع آوری شده از باغات توت فرنگی (احتمالا Chaetosiphon fragaefolii) تلقیح شدند که بعد از دو هفته علائمی شبیه به علائم ویروس SMoV در گیاه محک ظاهر شدند و آلودگی آن به این ویروس تایید شد. در ادامه این تحقیق به منظور بررسی بیشتر خصوصیات مولکولی، چند جدایه بر اساس منطقه جغرافیایی، رقم میزبان و نوع علایم انتخاب و مناطق کد شونده آران ای شماره دو شامل ژن پروتئین پوششی و پروتئین حرکتی از چهار جدایه تکثیر و توالی یابی شدند. در آنالیز نوترکیبی، اتفاق نوترکیبی در این جدایه ها مشاهده نشد و از لحاظ ماهیت سایت برشی، تفاوتی با سایر جدایه های شناخته شده این ویروس وجود نداشت. در بررسی تبارزایی هر چهار جدایه در یک کلاد قرار گرفتند. در ارزیابی فاصله ژنتیکی جدایه های این تحقیق با سایر جدایه های ژنبانک جدایه KM (مریوان) به جدایه 19SP059E از کشور کانادا (شماره دسترسی MZ328087)، جدایه PK (سنندج) و جدایه 13A(سنندج) به جدایه C از کشور جمهوری چک (شماره دسترسی MH013327) و جدایه SA(کامیاران) به جدایه T1 از کشور ژاپن (شماره دسترسی LC550286) بیشترین شباهت نوکلئوتیدی را نشان دادند. این اولین گزارش از ردیابی و تعیین مشخصات مولکولی ویروس SMoV در مزارع توت فرنگی استان کردستان می باشد.

Tomato (Solanum lycopersicum) is one of the important Solanaceous vegetables that were used extensively as a model plant for biotechnology research areas, because of its simplicity to work and economic importance. This plant encounters with several important fungal and viral pathogens, such as Cucumber mosaic virus (CMV) and Alternaris spp. which cause yield reduction in the fields and as a post-harvest disease. However, the investigation in plant-pathogen and pathogens-pathogen interactions is an important step for designing and developing stable control of these diseases. RNA silencing as advanced technology was used for the control of plant diseases for more than 20 years. In this research, the effect of silencing of CMV-2b on CMV and Alternaria atra in tomato plants was investigated. The bioassay data in this study using detached leaf assay indicated that silencing of CMV-2b causes reduction of necrosis leaf spot by A. atra in plants mixed infected by CMV and A. atra, compare to control plants that CMV-2b was not silenced. Analysis of the bZIP60 expression using Real-time PCR revealed that CMV induces bZIP60 in infected plants, in comparison with healthy plants, while silencing of CMV-2b suppresses its expression. Results of this research showed A. atra reduces the expression of bZIP60 in tomato infected plants, and even, in mixed infected plants the bZIP60 expression showed down expression, despite the induction by CMV. Moreover, in this research the effect of programs cell death suppression on CMV-A. atra interaction was investigated using the transient expression of CED-9 gene. The results indicated that the expression of CED-9 reduces the necrosis spot induced by A. atra in tomato leaves, while the increment of CMV titer. However, this result shown the suppression of PCD in tomato plants for control of CMV and Alternaria in areas with mixed infection is not recommended. In overall, in this research the collected data were recommended silencing of CMV-2 for control of CMV and A. atra in areas with mixed infection.

ویروس لکه سبزرد برگ سیب متعلق به جنس Trichovirus و خانواده ی Betaflexiviridae است. این ویروس گسترش جهانی دارد و در میزبان های بسیاری مانند سیب، گلابی، هلو و گیلاس گزارش شده است. هدف از این مطالعه، بیان ژن پروتئین پوششی(CP) ویروس لکه سبزرد برگ سیب در باکتری Escherichia coli بدون نیاز به خالص سازی ویروس برای تولید پادتن بود. بیان پروتئین پوششی نوترکیب، نیاز به خالص سازی ویروس را که مستلزم وجود اولتراسانتریفوژ است، مرتفع می سازد. به منظور تولید پروتئین پوششی نوترکیب، جدایه SSa از میزبان سیب جداسازی و ژن کامل پروتئین پوششی آن به طول 582 جفت باز با آغازگرهای اختصاصی تکثیر شد. ژن کامل CP به حامل همسانه سازی pTG19 متصل و در باکتری E. coli سویه DH5α ترانسفورم شد. باکتری های تراریخت شده به پلاسمید نوترکیب روی محیط کشت LB حاوی آمپی سیلین X-Gal و IPTG غربال و پلاسمید نوترکیب به روش لیز قلیایی استخراج گردید. پلاسمید استخراج شده با آنزیم های BamHl و XhoI با محل اثر در دو طرف محل اتصال دی ان ای خارجی برش داده شدند، قطعه ی مورد نظر پس از خالص سازی به حامل بیان pET28a(+)اتصال داده شد. pET28a(+) حاوی ژن CP ویروس ACLSV در باکتریBL21 E. coli ترانسفورم و سپس القای بیان CP با اضافه نمودن IPTG در غلظت نهایی 1mM پس از چهار ساعت SDS-PAGE بررسی شد. نتایج حاصل از SDS-PAGE حاکی از بیان پروتئین مذکور بود.

سیب به دلیل ارزش غذایی و صادراتی آن، یکی از محصولات مهم باغبانی در ایران به شمار می رود. در این پژوهش به منظور ردیابی و شناسایی مولکولی چهار ویروس Apple stem grooving virus (ASGV) ، (ASPV) Apple stem pitting virus ، (ACLSV) Apple chlorotic leaf spot virus و (ApMV) Apple mosaic virus ، نمونه برداری طی سال های 1396 و 1397 از برگ درختان سیب دارای علائم و در برخی موارد فاقد علائم ویروسی از باغات سیب استان کردستان انجام شد. استخراج RNA با روش سیلیکا از 174 نمونه برگی انجام شد. سپس، cDNA با آغازگرهای شش تایی تصادفی ساخته شد و حضور این چهار ویروس با آغازگرهای اختصاصی هر ویروس در آزمون RT-PCR بررسی شد. نتایج RT-PCR حاکی از آلودگی 36 نمونه به ASPV، 18 نمونه به ASGV و 17 نمونه به ACLSV بود و 17 نمونه بطور هم-زمان به چند ویروس آلوده بودند. ApMV در طی این تحقیق با وجود مشاهده علائم مشخصه آن بر روی برخی از نمونه ها، ردیابی نشد. به منظور تایید نتایج RT-PCR و آنالیز تبارزایی و تعیین مشخصات مولکولی ویروس های ردیابی شده، ژن کامل پروتئین پوششی (CP) ACLSV و ASGV بترتیب با اندازه های 589 و 714 جفت بازی از شش نمونه تکثیر و پس از اتصال در پلاسمید pTG19، در باکتری E. coli ترانسفورم و تعیین توالی شدند. همچنین، قسمتی از ژن CP از دو جدایه ویروس ASPV به صورت مستقیم توالی یابی شد. در بررسی تبارزایی،جدایه های ACLSV در گروه تبارزایی شناخته شده B6 در کنار جدایه هایی از ژاپن، چین، برزیل، لیتوانی، لتونی، هند و آلمان ، ASGV در گروه اول در کنار جدایه هایی از هند، چین، جمهوری چک، کره جنوبی، صربستان، ترکیه و ویروس ASPV در گروه اول در کنار جدایه هایی از چین، هند و کره جنوبی قرار گرفتند. میزان تنوع ژنتیکی جدایه های این تحقیق برای ACLSV و ASGV به ترتیب 007/0±0651/0 و 001/0±0053/0 محاسبه شد. همچنین دو جدایه ASPV توالی یابی شده در این تحقیق 6/99٪-3/97٪ با هم تشابه داشتند. بیشترین قرابت جدایه های این تحقیق با سایر جدایه های دنیا، در مورد ویروس ACLSV بیشترین قرابت بین جدایه D4 با BR از کشور برزیل و ویروس ASGV بین جدایه D3 با QY از کشور چین و ویروس ASPV بین جدایه NS با Palampur از کشور هند بود. بر اساس اطلاعات موجود، این اولین گزارش از حضور ASGV, ASPV, ACLSV در باغات استان کردستان هستند.

ویروئیدها، مولکول های RNA، فاقد پوشش پروتئینی، حلقوی، تک رشته ای، کوچک با طول 246 تا 401 نوکلئوتید وغیر کد کننده پروتئین هستند. ویروئید موزاییک نهفته هلو Peach latent mosaic viroid (PLMVd) از جنس Pelamoviroid و خانواده Avsunviroidae، گونه های مختلف جنس Prunusرا آلوده نموده و گسترش جهانی دارد. به منظور بررسی حضور و تعیین مشخصات مولکولی PLMVd در استان کردستان، طی بهار و تابستان 1394 و 1396 تعداد 132 نمونه برگی از هلو، آلو، زردآلو، شلیل، گیلاس، بادام و آلبالو از باغات استان جمع آوری شد. استخراج اسید نوکلئیک کل با استفاده از روش سیلیکا و سنتز cDNA با استفاده از آغازگرهای تصادفی شش تایی انجام شد. PCR با استفاده از آغازگرهای اختصاصی RF44/ RF43 منجر به تکثیر قطعه مورد انتظار bp350 در 36 نمونه شد.در مراحل بعدی تحقیق، فرآورده PCR نمونه های K2, K5, K6, K9, D6 و S2 به صورت مستقیم و نمونه های KH10, BH5, D1, D2, D4, K3, Ba.8, Bsh4, Bsh9, S1 و MH35 پس از اتصال به پلاسمید pTG19-T و همسانه سازی در باکتری E. coli DH5α با استفاده از آغازگر T7 promoter تعیین توالی شدند. توالی های به دست آمده PLMVd در بانک ژن ثبت و هم ردیف سازی این توالی ها با سایر توالی های این ویروئید، موجود در بانک ژن نشان داد که 97% تشابه نوکلئوتیدی بین جدایه های این تحقیق و 100-78% با سایر جدایه های گزارش شده وجود دارد. در بررسی تبارزایی، جدایه ها ی حاصل از این تحقیق با 23 جدایه ثبت شده در بانک ژن در سه گروه (I, II, III) قرار گرفتند که همه جدایه های این تحقیق در گروه I (جدایه های ایجاد کننده موزائیک) با جدایه هایی از هند، چین، اسپانیا، تونس، استرالیا و ایران هم گروه شدند. ساختار ثانویه ترسیم شده برای جدایه های D1 و KH10 حاکی از ساختارهای جدید در این جدایه ها بود. بنابر اطلاعات موجود، این اولین گزارش از ردیابی PLMVd از میزبان-های هسته دار استان کردستان و از میزبان های زردآلو، گیلاس، بادام و آلبالو برای ایران می باشد.

ویروس لکه حلقوی نکروتیک هسته داران (PNRSV) یکی از ویروس های مهم درختان هسته دار می باشد که هر سال خسارت فراوانی را با کاهش کمی و کیفی میوه ها موجب می شود. به منظور بررسی وضعیت PNRSV در استان کردستان، 149 نمونه مشکوک به آلودگی از میزبان-های هسته دار و دانه دار طی سال های 1394 و 1396 جمع آوری و استخراج RNA از بافت برگی با روش سیلیکا انجام شد. سپس، سنتز cDNA با آغازگرهای شش تایی تصادفی انجام و حضور PNRSV در نمونه ها با آغازگرهای اختصاصی ژن پروتئین پوششی در آزمون RT- PCR بررسی شدند. نتایج RT- PCR نشان داد که در مجموع 31 نمونه (8/20 درصد) آلوده به PNRSV بودند. به منظور بررسی آنالیز تبارزایی، تنوع ژنتیکی و فشار انتخاب بر ژن پروتئین پوششی این ویروس، 13 جدایه Sal53،SZ93 ، SZ26، BH11،KH10 ، DG1، B5، M، K6، S2، M4، D4 و D7 با توجه به میزبان و منطقه جغرافیایی انتخاب و ژن پروتئین پوششی آن ها پس از اتصال در پلاسمید pTG19، در باکتری E. coli همسانه سازی و تعیین توالی نوکلئوتیدی شدند. توالی های حاصل سپس با 37 جدایه قابل دسترس در پایگاه داده های نوکلئوتیدی از جمله جدایه های تعیین توالی -شده از ایران مورد مقایسه قرار گرفتند. نتایج مقایسه دو به دوی 553 نوکلئوتیدی از ژن پروتئین پوششی جدایه های توالی یابی شده در این تحقیق نشان داد که این جدایه ها 100-96 درصد در سطح اسید نوکلئیکی و 100-92 درصد در سطح آمینواسیدی با هم تشابه دارند. بیشترین نزدیکی بین جدایه های KH10، SZ93 و D7 با جدایه SHN-40 (KX353935) از ایران با 98% تشابه مشاهده شد و کمترین نزدیکی بین جدایه SZ26 با جدایه Emp (DQ983499) از لهستان با %6/83 تشابه مشاهده شد. بررسی نوترکیبی با RDP4 نشان داد که نوترکیبی در این قسمت از ژنوم اتفاق نیافتاده است و تغییرات در اثر جهش های نقطه ای به دست آمده است. همچنین نسبت های کم جانشینی مترادف به غیر مترادف (dN/dS) نشان داد که انتخاب منفی نقش عمده ای را در تکامل این ژن ویروس بازی کرده است. در آنالیز تبارزایی، جدایه های این تحقیق به همراه سایر جدایه های ایرانی در گروه تبارزاییPV96 قرار گرفتند. بر اساس اطلاعات موجود، این اولین گزارش از حضور PNRSV در باغات استان کردستان می باشد.

انگور یک فرآورده صنعتی و اقتصادی با ارزشی است که جایگاه ویژه ای را در بین محصولات کشاورزی در سراسر دنیا و ایران دارد. ویروس های خانواده Secoviridae از عوامل مهم بیمارگر انگور هستند که موجب خسارت اقتصادی در تاکستان ها می شوند. در تحقیق حاضر، نمونه برداری از تاکستان های استان زنجان در سال زراعی 96-94 به صورت انتخابی از گیاهان دارای علائم مشکوک به بیماری های ویروسی انجام شد که در مجموع 168نمونه گیاهی مشکوک به بیماری های ویروسی جمع آوری شد. استخراج آران ای کل از نمونه بافت های برگی جمع آوری شده مطابق روش روحانی و همکاران (1993) و ساخت cDNA مربوطه با استفاده از آغازگر شش نوکلئوتیدی انجام گرفت. پس از ساخت cDNA، با استفاده از آغازگرهای اختصاصی هر کدام از ویروس های متعلق به خانواده Secoviridae شامل (ویروس موزائیک آرابیس، ویروس بدشکلی انگور، ویروس برگ بادبزنی انگور، ویروس لکه حلقوی گوجه فرنگی و ویروس ای انگور)، آزمون PCR جهت تکثیر بخشی از ژنوم ویروس ها انجام گرفت. نتایج PCR حاکی از تکثیر قطعات موردانتظار از ویروس موزائیک آرابیس، ویروس بدشکلی انگور، ویروس برگ بادبزنی انگور، ویروس لکه حلقوی گوجه فرنگی و ویروس ای انگور در نمونه های مشکوک مورد بررسی بود. سپس توالی برخی از محصولات PCR در مورد هرکدام از ویروس ها به دست آمد. پس از تعیین توالی محصولات PCR، همردیف سازی آن ها با سایر توالی-های موجود در بانک ژن انجام و درخت فیلوژنتیکی مربوط به هر ویروس توسط برنامه MEGA 7 ، با روش Neighbor-joining ترسم شد. نتایج حاکی از آلودگی نمونه های جمع آوری شده به ویروس موزائیک آرابیس، ویروس بدشکلی انگور، ویروس برگ بادبزنی انگور، ویروس لکه حلقوی گوجه فرنگی و ویروس ای انگور بود. بررسی روابط فیلوژنتیکی بر اساس توالی های اسیدنوکلئیکی نشان داد که جدایه های ردیابی شده در این تحقیق با جدایه هایی از کشورهای مختلف هم گروه می باشند که در اکثر ارتباط بین جغرافیایی بین جدایه های ردیابی شده و سایر جدایه ها را نشان می دهد.

ویروس موزاییک هندوانه (Watermelon mosaic virus, WMV) یکی از گونه های مهم جنس Potyvirus از خانواده ی Potyvirdae است. این ویروس پیکره های رشته ای انعطاف پذیر به طول حدود nm 760 دارد و ژنوم آن به صورت RNA تک رشته و مثبت می باشد. WMV در مقایسه با سایر پوتی ویروس های گیاهی دامنه ی میزبانی وسیع تری دارد و باعث خسارت اقتصادی به بسیاری از محصولات عمدتا کدوئیان می شود. به منظور ردیابی ویروس موزاییک هندوانه از جالیز کاری های استان کردستان، طی تابستان سال 1393، 56 نمونه برگی از میزبان های بادمجان، خیار، کدو، گوجه فرنگی، لوبیا سبز و هندوانه که دارای علائم مشکوک به این ویروس بودند، جمع آوری شد. ابتدا آر.ان.ای کل مطابق روش بهینه شده ی روحانی و همکاران (1993) استخراج و سپس، با استفاده از آغازگر های شش نوکلئوتیدی تصادفیcDNA مربوط به آن ها ساخته شد. در نهایت، محصولات cDNA به عنوان الگو برای تکثیر قسمتی از ژن پوشش پروتئینی ویروس موزائیک هندوانه در واکنش زنجیره ای پلیمراز با استفاده از آغازگرهای WMV (CP-f)/ WMV(CP-r) به کار گرفته شد. نتایج الکتروفورز روی ژل آگارز 2/1%، حاکی از تکثیر قطعه مورد انتظار حدود 657 جفت بازی در 21 نمونه (37 درصد) از نمونه های مورد مطالعه بود .در کل بر اساس نتایج آرتی-پی سی آر، 35%، 55%، 17%، 40% و 67% از نمونه های مورد مطالعه در میزبان های خیار، کدو، گوجه فرنگی، لوبیا سبز و هندوانه به ترتیب آلوده به ویروس موزاییک هندوانه بودند. در حالیکه، این ویروس از میزبان بادمجان ردیابی نشد. قطعات تکثیر شده از 10 نمونه ی، B21،B22 ، C49 ،C44، W5، W1، H7، Z3، Z6، Z17 پس از اتصال به پلاسمید pTG19 در میزبان باکتریایی E.coli DH5αترانسفورم شدند. باکتری های ترانسفورم شده با پلاسمید نوترکیب بر روی محیط کشت حاوی آمپی سیلین،IPTG و XGal انتخاب و پلاسمید نوترکیب حاوی قطعه پی سی آر، از باکتری های ترانسفورم شده استخراج گردید. قطعات پی سی آر موجود در پلاسمید های نوترکیب با استفاده از آغازگر T7- promoter تعیین توالی شدند و توالی های به دست آمده شامل 657 نوکلئوتید همراه با 81 ترادف انتخاب شده از بانک ژن مقایسه شدند. همردیف سازی های چندگانه و آنالیز فیلوژنتیکی و تعیین نسبت جانشینی نامترادف (dN) به جانشینی مترادف (dS) با نرم افزار هایMEGA6 و DNaSp انجام و درخت فیلوژنتیک به روش ماکسیمم لایکلی

ویروس برگ بادبزنی مو (Grapevine fanleaf virus, GFLV) و ویروییدهای لکه زرد 1 مو (GYSVd-1 Grapevine yellow speckle viroid-1,) و لکه زرد 2 مو (Grapevine yellow speckle viroid-2, GYSVd-2) گسترش جهانی دارند. در اثر آلودگی توام این بیمارگرها بر شدت علایم افزوده و منجر به ایجاد بیماری رگ نواری می شود که به طور جدی میزان و کیفیت محصول مو را تحت تاثیر قرار می دهد. وقوع عوامل ذکر شده از اغلب مناطق اصلی کشت مو در ایران نیز گزارش شده است. از این رو، معرفی یک روش دقیق، سریع و ارزان برای ردیابی هم زمان این عوامل می تواند نقش مهمی را در جلوگیری از انتشار و گسترش خسارت آن ها و نیز غربال گیاهان سالم داشته باشد. در پژوهش حاضر یک روش(mRT-PCR) Multiplex RT-PCR جهت ردیابی هم زمان GFLV، GYSVd-1، GYSVd-2 و نیز HSVd به عنوان کنترل داخلی، با استفاده از cDNA نمونه های آلوده به این عوامل بهینه سازی شد. واکنش پی سی آر با استفاده از آغازگرهای اختصاصی برای هر کدام از این عوامل به صورت جداگانه و یا در ترکیب با یکدیگر منجر به تکثیر قطعه های مورد انتظار در حدود 126، 229، 302 و 451 جفت باز به ترتیب مربوط به GYSVd-1، GYSVd-2، HSVd و GFLV گردید. برای اعتباردهی بیشتر، 24 نمونه از تاکستان های شمال غرب کشورکه قبلا آلودگی آن ها به ترکیب های مختلف این عوامل محرز شده بود، مجددا با این روش مورد آزمون و مقایسه قرار گرفتند که نتایج حاکی از کارایی روش بهینه شده در این تحقیق داشت. همچنین، روش mRT-PCR بهینه شده طی این تحقیق برای ردیابی این بیمارگرها از تاکستان های مختلف استان کردستان به کار گرفته شد. به همین منظور، تعداد 36 نمونه برگی از نمونه های جمع آوری شده در طی اواسط مرداد تا اواخر شهریور ماه سال 1394 مورد ردیابی قرار گرفتند. پس از استخراج آران ای کل از بافت برگ نمونه ها، سنتز دی.ان.ای مکمل توسط آغازگرهای تصادفی شش تایی انجام و به عنوان الگو در آزمون mRT-PCR توسط مخلوطی از آغازگرهای اختصاصی این عوامل مورد استفاده قرار گرفت. الکتروفورز محصولات PCR بیانگر تکثیر قطعه های مورد انتظار برای GYSVd-1، GYSVd-2 و GFLV به ترتیب در 22، 21 و 7 نمونه بود. ردیابی این بیمارگرها با روش mRT-PCR از تاک های مورد بررسی نشان داد که تاکستان های استان کردستان به صورت گسترده به این عوامل آلوده هستند. برای اطمینان از اختصاصیت قطعه ها

ویروس های موزائیک خیار (CMV)، موزائیک زرد کدو (ZYMV) و موزائیک پیسک سبز خیار (CGMMV) با گسترش جهانی، دارای تهدید جدی برای محصولات کشاورزی هستند و هر ساله باعث خسارت جدی از نظر کیفی و کمی می شوند. در پژوهش حاضر به منظور ردیابی این سه ویروس از مزارع جالیز استان کردستان طی بهار، تابستان و پاییز سالهای 1392، 1393 تعداد 81 نمونه برگی بادمجان، خیار، فلفل، کدو، گوجه فرنگی و لوبیاسبز مشکوک به آلودگی جمع آوری شد. علائم عمدتاً شامل موزاییک، بدشکلی، رگ نواری، لکه های نکروتیک و کوتولگی بودند. در مایه زنی مکانیکی، عصاره برگ نمونه های مشکوک به آلودگی با این سه ویروس روی گیاهان محک سلمه تره (Chenopodium quinoa)، خیار (Cucumis sativus)، کدو (Cucurbita pepo)، توتون (Nicotiana tabacum) و لوبیاسبز (Phaseolusvulgaris) با بافر فسفات پتاسیم 1/. مولار و pH=7 مایه زنی شدند. دو نمونه W1 و ZMK4بعد از مایه زنی در گیاه خیار با ایجاد علائم بدشکلی منجر به انتقال CMV و ZYMV شدند. به منظور ردیابی ویروس های مورد نظر، استخراج آران ای کل از نمونه های مشکوک انجام و سنتز دی ان ای مکمل با استفاده از آغازگرهای تصادفی شش تایی انجام شد.CMV و ZYMV در 21% از نمونه ها ردیابی شد ولی CGMMV یافت نشد. آلودگی مخلوط CMV/ZYMV در شش نمونه (5/7%) دیده شد.پی سی آر با آغازگرهای اختصاصیCMV(f)/CMV(r) و ZYMV(f)/ZYMV(r) به ترتیب منجر به تکثیر قطعه ی مورد انتظار به طول bp867 مربوط به CMVو قطعه bp432 مربوط به ZYMVاز ژن پروتئین پوششی در 17 نمونه آلوده به این ویروس شد ولیCGMMV در هیچکدام از نمونه ها ردیابی نشد.به منظور بررسی صحت قطعات تکثیر یافته فرآورده پی سی آر دو نمونه W1 و Z3 با قطعه ی bp867 به صورت مستقیم و قطعه bp432 مربوط به ایزوله B21پس از همسانه سازی برای تعیین توالی فرستاده شدندبدین منظور فرآورده پی سی آر به پلاسمید pTG19-T متصل و در باکتری E. coliDH5αکلون شد. باکتری های ترانسفورم شده با پلاسمید نوترکیب روی محیط کشت حاوی آمپی سیلین، IPTG و X-Gal انتخاب و غربال شده و پلاسمید نوترکیب حاوی قطعه پی-سی آر، از باکتری های ترانسفورم شده استخراج گردید. پلاسمیدهای نوترکیب با استفاده از آغازگر T7 promotor تعیین توالی شد و توالی های CMV و ZYMV در بانک ژن ثبت گردید. هم ردیف سازی توالی CMV،8/98 % تشابه بین ایزوله های Z3 و W1 را نشا

بیماری های ویروسی ناشی از نپوویروس ها از مخرب ترین بیماری های ویروسی مو در سراسر جهان به حساب می آیند که با نماتدهای خانواده Longidoridae منتقل می شوند. این ویروس ها غالبأدارای میزبان-های طبیعی زیادی دربین گیاهان زینتی و غیر زینتی و درختان میوه و علف های هرز می باشند. پیکره اعضأ این جنس دوذره ای، جورقطر و به قطر حدود 30 نانومتر می باشد. غلظت این ویروس ها در گیاه و به ویژه مو پایین است و در نتیجه ردیابی آن ها را مشکل می سازد.در این تحقیق کوشش به عمل آمد تاویروس-های مهم مو از تاکستان های استان کردستان مورد ردیابی قرار گیرد. به همین منظور در طول فصول تابستان و پاییز سال های 1391 و 1392 از تاکستان های شهرهای مختلف استان کردستان(سنندج، کامیاران، مریوان، سروآباد، اورامان، سقز، دیواندره، بانه و بیجار) نمونه برداری از درختچه های دارای علائم ویروسی و همچنین بدون علائم مشخص انجام گرفت. مجموعه ای از علائم احتمالی ناشی از ویروس که شامل زیگزاگی شدن ساقه، موزائیک، کوتاهی فاصله میان گره، دوقلو شدن جوانه،کوتولگی، رگبرگ زردی و بدشکلی می باشدبه صورت تکی یا ترکیبی از آن ها مشاهده شد. برای ردیابی دقیق نمونه های جمع آوری شده، از روش مولکولی آرتی.پی سی آر استفاده شد. به این منظور، ابتدا آران ای کل از برگ های جمع-آوری شده استخراج و تهیه دی ان ای مکمل با استفاده از آغازگر راندوم هگزامر انجام گرفت. سپس؛ آزمون پی سی آر با به کار گرفتن جفت آغازگرهای اختصاصی برای ژن رمزکننده پروتئین پوششی انجام گرفت. نتایج حاصل از این تحقیق نشان داد که ویروس هایGFLV، ArMV، ToRSV، TBRS و RbRSV به ترتیب به میزان 54/14%، 18/1%، 27/7%، 18/1% و 45/5% در بین نمونه های مورد مطالعه ردیابی شدند.ویروس هایGFLV، ArMV، ToRSV، TRSV، RbRSV برای اولین بار با روش RT-PCR از استان کردستان و ویروس های RpRSV و TRSV برای اولین بار در تاکستان های ایران گزارش می شوند.نتایج حاصل از این تحقیق بیانگر آن است که با توجه به آلودگی چند ویروس مذکور در مناطق مورد تحقیق، استفاده از روش دقیق و حساس RT-PCR برای تشخیص پایه های مادری عاری از ویروس ضروری به نظر می رسد.

ویروسY سیب زمینی گونه ی تیپ جنس Potyvirus از خانواده Potyviridae می باشد. که از مهم ترین ویروس های سیب زمینی است وگسترش جهانی داشته و سبب کاهش عملکرد وکیفیت محصول سیب زمینی می شود. ذراتPVY میله ای خمش پذیر بوده و ژنوم آن به صورت RNA تک رشته ای سنس مثبت، حدود 9.7 تا 10 کیلو جفت باز است که 10-9 پروتئین را رمزگذاری می کند که یکی از آن ها CP بوده و نزدیک انتهای ´3 قرار دارد در انتهای ´5 ژنوم این ویروس VPg (پروتئین متصل ژنوم ) و در انتهای´3 به صورت پلی آدنینی قرار دارد. این ویروس از طریق تماس شاخ و برگ یا غده در بین گیاهان پراکنده می شود. اگر چه، انتقال با شته مهم ترین راه انتشار طبیعی ویروس محسوب می شود. هدف از این تحقیق، بیان ژن پروتئین پوششی ویروس Y سیب زمینی در باکتریEscherichia coli Rosetta بود تا با تولید آن، امکان تولید آنتی بادی نوترکیب در برابر آن فراهم گردد. برای این منظور بخشی از آر ان ای ویروس موجود در آزمایشگاه با استفاده از آغازگرهای اختصاصی منطبق بر منطقه ژن cpاز روی cDNA سنتز شده با آغازگر تکثیر داده شد. در این تحقیق، قطعات DNA bp801 به پلاسمید pGEM-T متصل و در باکتریDH5α E. coli کلون شدند. سپس، پلاسمید نوترکیب حاوی ژن مورد نظر با روش لیز آلکالینی از باکتری های ترانسفورم شده استخراج و برش آنزیمی با آنزیم های BamHI و SacI برروی این پلاسمید انجام شد. قطعه مورد نظر، به حامل بیان(+) pET21a برش داده شده توسط آنزیم های BamHI و SacI اتصال داده شد. پس از بیان پروتئین پوششی PVY درE.coli وزن مولکولی پروتئین نوترکیب استخراج شده در SDS-PAGE و وسترن بلات بررسی شد. وزن مولکولی مورد انتظار این پروتئین در حدود 35 کیلو دالتون بود. نتایج به دست آمده با دو روش مذکور تایید کننده بیان ژن مورد نظر بودند.

Cucumber mosaic virus (CMV) یکی از مهم ترین ویروس های آلوده کننده اعضای خانواده کدوئیان و متعلق به جنس Cucumovirus و خانواده Bromoviridae می باشد. این ویروس دارای دامنه میزبانی بسیار وسیعی است و گونه های گیاهی زیادی از خانواده های مختلف را آلوده می کند. آن دارای ژنوم چند بخشی شامل سه قطعه آران ای تک رشته ای، دو آران ای زیرژنومی و در برخی از جدایه ها دارای آران آی ماهواره ای است.RNA1 به عنوان بزرگترین قطعه ژنوم ویروس بوده و دارای 3357 نوکلئوتید است و پروتئین 1a را کد می کند. RNA2 حاوی 3050 نوکلئوتید و پروتئین 2a را رمز می کند. RNA3 حاوی حدود 2200 نوکلئوتید و دارای دو سیسترون 3a و CP می باشد. پروتئین 3a توسط ORF قرار گرفته در مجاورت ´5 رمز می شود. دومین ORF موجود در ORF3، پروتئین پوششی (26 کیلو دالتون)را کد می کند که در طرف ´3 مولکول RNA3 قرار گرفته و از طریق RNA4 زیر ژنومی کد می شود. این پروتئین به همراه پروتئین 3a (پروتئین حرکتی) برای حرکت سلول به سلول در میزبان مورد نیاز هستند. پروتئین های 1a و 2a نیز در همانندسازی ویروس ضروری هستند. ذرات ویروسی چند وجهی به قطر 29 نانومتر و بدون غلاف هستند و در طبیعت توسط شته ها به روش ناپایا منتقل می شوند. این ویروس بر طبق خصوصیات سرولوژیک و ترادف نوکلئوتیدی در دو زیرگروه طبقه بندی می شوند. هدف این پژوهش، بیان ژن پروتئین پوششی ویروس موزاییک خیار در سیستم پروکاریوتی باکتریRosetta Escherichia coli بود. بخشی از آر ان ای سوم ویروس CMV ( استرین B13) که پروتئین پوششی را رمز می کند، قبلا با استفاده از آغازگرهای اختصاصی از روی cDNA تکثیر و همسانه سازی شده بود. در این تحقیق از کلونی باکتریایی همسانه شده ی واجد pTZ57CMVCP پلاسمید رشد داده شد و به روش لیز آلکالینی استخراج شد. سپس برش آنزیمی با آنزیم های BamHI و SacI برروی این پلاسمید انجام شد. قطعه مورد نظر، به حامل بیان pET21a(+) برش داده شده توسط آنزیم های BamHI و SacI اتصال داده شد و این فراورده به درون باکتری E.coli انتقال داده شد. پس از بیان پروتئین پوششی CMV در E.coli strain Rosseta gami، اندازه ی آن در SDS-PAGE بررسی شد. وزن مولکولی این پروتئین در حدود 30 کیلو دالتون بود که بدون احتساب چند اسیدآمینه افزوده شده توسط انتهاهای N و Cحامل، با اندازه ی پروتئین پوششی CMV که KDa 26 است، مطاب